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     LIQUID BIOPSY

Liquid Biopsy am MGZ

Jeder Tumor setzt zellfreie DNA (engl. circulating tumor DNA (ctDNA)) in die Blutzirkulation frei. So können somatische Sequenzvarianten von Tumoren im Blutplasma nachgewiesen werden und als prognostische oder prädiktive Marker verwendet werden.

Liquid Biopsy am MGZ kann für gezielte Analysen zum Nachweis von Tumor-Hotspot-Varianten mit therapeutischer Relevanz aus Blutplasma von Tumorpatienten angewendet werden. Diese auf der ddPCR (Droplet Digital™ PCR, Bio-Rad) basierende Methode ermöglicht den zuverlässigen Nachweis von Tumor-Hotspot-Varianten aus zirkulierender Tumor DNA (engl. circulating tumor DNA (ctDNA)), auch bei sehr geringer Menge von ctDNA im Blut. Der direkte Nachweis dieser Therapie-relevanten somatischen Varianten aus Blutplasma ermöglicht eine nicht-invasive Diagnostik, um Informationen für die weitere Therapieplanung zu gewinnen.

 

Liquid Biopsy

 

ESMO-Leitlinien für Nichtkleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC)

Therapieempfehlung:

Vor Erstlinientherapie sollte eine Analyse folgender Therapie-relevanten somatischen Varianten durchgeführt werden: EGFR p.T790M (Häufigkeit 2 %, bei Resistenzen 50-60 %), EGFR p.L858R (Häufigkeit 8 %), Exon 19 Deletionen (Häufigkeit 13 %) und BRAF p.V600E (Häufigkeit 2 %).

 

Tabelle 1:
Übersicht über Therapie-relevante somatische Varianten und in Europa zugelassenen Medikamente

     

Somatische Variante

 

Zugelassene Medikamente

 

EGFR

 

Alle Aktivierenden Varianten

 

Erlotinib, Gefitinib, Afatinib, Dacomitinib, Osimertinib

 

EGFR

 

Resistenz p.T790M Variante

 

Osimertinib

 

BRAF

 

p.V600 Varianten

 

Dabrafenib + Trametinib

 

Tabelle 2:
Übersicht über die am MGZ mittels Liquid Biopsy nachweisbaren Therapie-relevanten somatischen Varianten

      EGFR
p.T790M

  EGFR
p.L858R

  EGFR
Exon 19 Deletionen*
  BRAF
p.V600E

 
  Therapieentscheidung

 

 

 

 

 
 

Detektion-Resistenz

 

 

 

     
             

* die 15 häufigsten Deletionen in einem Assay

 

Methodik
Das angewandte Testverfahren (Droplet Digital™ PCR, Bio-Rad) ermöglicht durch die Partitionierung einer Probe in bis zu 20.000 Droplets den zuverlässigen Nachweis und die Quantifizierung von Tumor-Hotspot-Varianten aus zirkulierender Tumor-DNA (engl. circulating tumor DNA (ctDNA)), auch bei sehr geringer Menge von ctDNA im Plasma. Das Testverfahren wurde bei uns am MGZ entsprechend aktueller Guidelines validiert und ermöglicht die Ermittlung der Allelfrequenz von Tumor-Hotspot-Varianten bei Tumor-Patienten.

Diese Nachweis- (LOB), Erfassungs- (LOD) und Bestimmungsgrenzen (LOQ) gelten nur für EGFR-Einzelanlaysen, BRAF p.V600E und bei der Einsendung von vier Streck-Blutröhrchen bei den Testoptionen 1, 2 und 3. Die Assays erreichen eine Sensitivität und Spezifität von mindestens 95 %.

Für die Testoptionen 1, 2, und 3 mit zwei Streck-Blutröhrchen gelten die Erfassungsgrenzen (LOD): 0,1% -1%.

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EGFR exon 19
deletions screening kit

 

Droplet Digital™ PCR zur gezielten Mutationsanalyse der 15 häufigsten Deletionen in Exon 19 des EGFR Gens. Die Auswertung der erhobenen Daten für die Bestimmung der Allelfrequenz der analysierten Varianten erfolgt mittels QX Manager v1.1. Mit einem Konfidenzintervall von 95% werden bei ca. 20 ng Input-DNA ein LOB von 0.0%, ein LOD von 0.1% und ein LOQ von 0.7% erreicht.

 

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EGFR p.T790M Assay

 

Droplet Digital™ PCR zur gezielten Mutationsanalyse der EGFR c.2369C>T p.T790M Variante. Die Auswertung der erhobenen Daten für die Bestimmung der Allelfrequenz der analysierten Variante erfolgt mittels QX Manager v1.1. Mit einem Konfidenzintervall von 95% werden bei ca 20 ng Input-DNA ein LOB von 0.08%, ein LOD von 0.18% und ein LOQ von 0.5% erreicht.

 

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EGFR p.L858R Assay

 

Droplet Digital PCR zur gezielten Mutationsanalyse der EGFR c.2573T>G p.L858R. Die Auswertung der erhobenen Daten für die Bestimmung der Allelfrequenz der analysierten Varianten erfolgt mittels QX Manager v1.1. Mit einem Konfidenzintervall von 95% werden bei ca 20 ng Input-DNA ein LOB von 0.0%, ein LOD von 0.08% und ein LOQ von 0.53% erreicht.

 

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BRAF p.V600E Assay

 

Droplet Digital PCR zur gezielten Mutationsanalyse der BRAF c.1799T>A p.V600E. Die Auswertung der erhobenen Daten für die Bestimmung der Allelfrequenz der analysierten Varianten erfolgt mittels QX Manager v1.1. Mit einem Konfidenzintervall von 95% werden bei ca 20 ng Input-DNA ein LOB von 0.02%, ein LOD von 0.4% und ein LOQ von 0.52% erreicht.

Sensitivität
Mit dem ddPCR-Workflow ist es möglich, Therapie-relevante somatische Varianten bei niedrigen Frequenzen in geringen Probenmengen zuverlässiger zu detektieren als mit Next Generation Sequencing (NGS)-basierten Technologien. Bei den NGS-basierten Technologien ist nur eine theoretisch berechnete Erfassungsgrenze angegeben, welche u.a. wesentlich von der Menge der eingesetzten DNA abhängig ist, die sehr unterschiedlich sein kann. Mit dem ddPCR-Workflow haben alle Assays hingegen eindeutig validierte Nachweisgrenzen für die Unterscheidung zwischen positiven und negativen Ergebnissen, Erfassungsgrenzen, und Bestimmungsgrenzen zur Quantifizierung der Frequenz der somatischen Varianten. Die Assays erreichen eine Sensitivität und Spezifität von mindestens 95 %.

 

Abbildung: Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze unserer validierten ddPCR Assays

 

 

 

Vergleich der Grenzwerte für die Detektion und Quantifizierung somatischer Varianten aus zellfreier DNA (cfDNA) von verschiedenen ddPCR Assays und NGS panels (Nachweisgrenze: engl. limit of blank (LOB); Erfassungsgrenze: engl. Limit of detection (LOD); Bestimmungsgrenze: engl. limit of quantification (LOQ))

Neben der Detektion von Therapie-relevanten somatischen Varianten ist eine verlässliche Quantifizierung für die Therapieentscheidung sehr wichtig. Durch die Validierung unserer ddPCR Assays gemäß höchster Standards für klinische und molekulargenetische Tests ist eine exakte Quantifizierung bereits ab einer Frequenz von 0,5 % Therapierelevanter somatischer Varianten im Plasma möglich.

LOQ (EGFR Del19): 0,7 %, LOQ (EGFR T790M): 0,5 %, LOQ (EGFR L858R): 0,53 %, LOQ (BRAF V600E): 0,52 %
Diese Nachweis- (LOB), Erfassungs- (LOD) und Bestimmungsgrenzen (LOQ) gelten nur für EGFR-Einzelanlaysen, BRAF p.V600E und bei der Einsendung von vier Streck-Blutröhrchen bei den Testoptionen 1, 2 und 3.

Für die Testoptionen 1, 2, und 3 mit zwei Streck-Blutröhrchen gelten die Erfassungsgrenzen (LOD): 0,1% -1%. Hinwei: Eine Erhöhung der Detektionsrate ist ohne zusätzliche Kosten verbunden (Voraussetzung: Einsendung von vier Streckblutröhrchen =40 ml).