Die Implementierung von Next-Generation-Sequencing (NGS) in die genetische Diagnostik erlaubt eine schnelle, parallele und kosteneffiziente Analyse von krankheitsrelevanten Genen und vervollständigt das Leistungsangebot unseres Labors. Um diese Technologie bei ausgewählten Patienten auch in der genetischen Routinediagnostik einsetzen zu können, bieten wir neben der Analyse einzelner Gene mittels Sanger-Sequenzierung die Analyse von diagnostischen Gen Panels mit modernsten NGS Technologien an. Dies ermöglicht eine parallele Untersuchung mehrerer Gene, die gleichzeitig den hohen Standards einer diagnostischen Analyse im Hinblick auf die Qualität der Daten und Interpretation der gefundenen Sequenzvarianten gerecht wird.
Je nach klinischer Fragestellung werden unterschiedliche Stufen der diagnostischen Tiefe (NGS Qualitätsstufen A-C ; "Guidelines for diagnostic next generation sequencing", EuroGentest, 2014) angewendet. Detaillierte Informationen finden sie hier.
NGS Analyse
- Die Anreicherung spezifischer Regionen des Genoms erfolgt mit Agilent SureSelectXTTM oder Twist Kits, anschließend wird eine parallele "paired-end" Sequenzierung auf dem NovaSeq, NextSeq 500 oder MiSeq IlluminaR Analyzer durchgeführt.
- Analysiert werden alle kodierenden Exons sowie die Exon/Intron Übergänge (+/- 5 bp) bezüglich Punktmutationen und kleiner Insertionen/Deletionen (bis ca. 50 bp).
- Der Befund enthält eine ausführliche Interpretation der identifizierten Varianten durch ein erfahrenes Team von biomedizinischen Experten und Fachärzten für Humangenetik. Zusätzlich werden im Befund die analysierten Bereiche, deren Abdeckung, sowie weitere Daten zur Qualität der Analyse angegeben.
Diagnostische Qualitätskriterien der NGS Analyse
Wir garantieren folgende Qualitätskriterien für die NGS-Analyse:
- Eine mittlere Sequenzierungsqualität (Q-phred Score) größer 30 pro Sequenzierzyklus (entspricht einer 99,9% -igen Detektionsgenauigkeit).
- Eine Sequenziertiefe von über 20 Sequenzen pro Base in mindestens 98% der untersuchten Bereiche; über Bereiche, die mit weniger Sequenzen pro Base abgedeckt sind, kann keine sichere Aussage getroffen werden.
- Zusätzlich sind unsere NGS Panels nach aktuellen NGS Diagnostik Richtlinien1 validiert um eine ausreichende Sensitivität und Spezifizität für ein akkurates "variant calling" zu gewährleisten.
- Je nach klinischer Fragestellung werden unterschiedliche Stufen der diagnostischen Tiefe angewendet (Qualitätsstufen von Typ A bis Typ C)2 .
- Parallel zur NGS Analyse wird bei jedem Patienten der Genotyp an 16 polymorphen Loci bestimmt, um eine Kontamination und/oder Probenvertauschung im Laufe der NGS-Analyse auszuschließen.
1 Empfehlung gemäß "Eurogentest Guidelines for diagnostic next generation sequencing" (EuroGentest, 2014) und "ACMG clinical laboratory standards for next-generation sequencing" (Genetics in Medicine, 2013, 15:733-747).
2 Bei der Analyse von BRCA1/2 und den Multi-Gen Panel HNPCC und DMD werden besondere Qualitätskriterien angelegt. Hier wird eine Sequenziertiefe von mehr als 20 Sequenzen pro Base in 100% der analysierten Regionen gefordert, zusätzlich erfolgt eine MLPA bezüglich der Detektion von größeren Insertionen/Deletionen.
Limitierungen
- Mögliche regulatorische Mutationen in intronischen Bereichen (> +/- 5 bp zur Exongrenze) werden nicht analysiert.
- Methodisch bedingt können zum gegenwärtigen Zeitpunkt größere genomische Deletionen oder Duplikationen (>50 bp) sowie strukturelle Rearrangements (Translokationen und Inversionen) nicht verlässlich detektiert werden. Hier ist, abhängig von der Fragestellung, zusätzlich eine Gendosis-Untersuchung nötig (z.B. MLPA, Array-CGH-Diagnostik).
- Auch können Repeat-Expansionen in Genen wie z.B. HDD, FMR1, FXN und DMPK nicht dargestellt werden.
- Die Analyse von Genen mit bekannten Pseudogenen bzw. homologen Regionen ist zum gegenwärtigen Zeitpunkt nur eingeschränkt möglich (z.B. CHEK2 und PMS2).